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修正「食品中动物性成分检验方法-牛成分之定性检验」

来源:未知 作者:admin 人气: 发布时间:2019-05-28
摘要:中华民国一百零二年十一月二十七日卫生福利部部授食字第1021951074号公告修正全文;并自即日生效11.适用範围:本检验方法适用于食品中牛成分之定性检验。22.检验方法:检体经DNA萃取后,以即时聚合链反应(real-timepol-ymerasechainreaction,real-timePCR
中华民国一百零二年十一月二十七日卫生福利部部授食字第102195107 4号公告修正全文;并自即日生效 11.适用範围:本检验方法适用于食品中牛成分之定性检验。 22.检验方法:检体经DNA萃取后,以即时聚合链反应(real-timepol- ymerasechainreaction,real-timePCR)之方法。 2.1.工作环境:工作平台需宽敞、洁净、光线良好。检体前处理、检体 DNA抽取、real-timePCR试剂配製及检验过程皆需有区隔空间,避 免交叉污染。Real-timePCR试剂之配製应于无菌操作台内进行。 2.2.装置(注1) 2.2.1.即时聚合链反应器:ABIPRISM7900HTSequenceDetection System?或RocheLightCycler,或同级品。 2.2.2.冷冻乾燥装置:温度可达-40℃以下,真空度可达133mBar以下 ,供检体乾燥用。 2.2.3.振荡型粉碎机:RetschMM200,或同级品。 2.2.4.真空乾燥装置:供DNA乾燥用。 2.2.5.高压灭菌釜。 2.2.6.无菌操作台。 2.2.7.加热振荡器:具55℃温控及振荡功能。 2.2.8.微量冷冻离心机(Microrefrigeratedcentrifuge):可达200 00?g,并具4℃温控功能。 2.2.9.离心机:供各式微量离心管离心用。 2.2.10.分光光度计:具波长260nm、280nm。 2.2.11.冷冻设备:具冷藏及冻结功能。 2.2.12.旋涡混合器(Vortexmixer)。 2.2.13.酸硷度测定仪(pHmeter)。 2.2.14.水浴装置:温差±1℃以内者。 2.2.15.天平:最大称重量为2000g,灵敏度为0.1g;最大称重量为 100g,灵敏度为1mg。 注1:本方法所使用或提及之产品品牌不代表为同类产品中最好 者;反之,未使用或提及之产品品牌亦不代表为同类产品 中较差者。 2.3.试药 2.3.1.DNA抽取用试药:乙醇(96-100%)採分子生物分析级试药;适用 于动物DNA抽取之市售套组。 2.3.2.Real-timePCR用(注2) 2.3.2.1.鉴别试验用引子及探针 2.3.2.1.1.哺乳类、家禽类及鱼类(标的基因:12SribosomalRNA,供 作内部对照基因) 引子F:12SF,5’-CAAACTGGGATTAGATACCCCACTA-3’ 引子R:12SR,5’-ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3’ 探针P:12SP,5’-(FAM)-CACCGCCAAGTCCTTTGRGTTTTARGC -(TAMRA)-3’ PCR增幅产物大小155bp 2.3.2.1.2.牛(标的基因:12SribosomalRNA) 引子F:BF,5’-ACATTCTCTACCCAAGAGAATCAAGC-3’ 引子R:BR,5’-TCCTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTA-3’ 探针P:BP,5’-(FAM)-CCCTCCTCAAATAGATTCAGTGCATCTAAC CCT-(TAMRA)-3’ PCR增幅产物大小193bp 注2:1.合成之引子及探针,拆封后,以无菌去离子水稀释成 适当浓度,分装后置于-20℃贮存备用,另探针需避 光保存。探针5’端採用6-carboxy-fluorescein( FAM)标记,3’端採用6-carboxytetramethylrh- odamine(TAMRA)标记。 2.内部对照基因引子及探针之序列中,R为混合硷基代 码(A/G),表示同时含A及G;M为混合硷基代 码(A/C),表示同时含A及C。 2.3.2.2.TaqManUniversalPCRMasterMix(适用于ABIPRISM7900H TSequenceDetectionSystem) 本试剂内含real-timePCR所需去氧核糖核三磷酸、聚合 等,使用时添加引子、探针及待测检体DNA。 2.3.2.3.LightCyclerFastStartDNAMasterHybProbe(适用于Roche LightCycler) 本试剂内含real-timePCR所需去氧核糖核三磷酸、聚合 等,且内附25mM氯化镁溶液,使用时添加引子、探针及待测 检体DNA。 2.3.3.对照用物质:牛肉或使用卫生福利部食品药物管理署提供编号S20 1之参考质体作为对照用物质。 2.4.器具及材料(注3) 2.4.1.吸管(Pipette):10μL、20μL、100μL、200μL及100 0μL。 2.4.2.吸管尖头(Pipettetips):10μL、20μL、200μL及1000 μL。 2.4.3.离心管:200μL、600μL、1.5mL及2mL。 2.4.4.PCR反应管:200μL。 2.4.5.PCR玻璃毛细管:RocheLightCycler专用。 2.4.6.玻璃或塑胶瓶:50mL、100mL、250mL、500mL、1000mL及 2000mL。 2.4.7.塑胶离心管:50mL。 注3:使用之塑胶或玻璃器皿均为无DNase污染。 2.5.Real-timePCR溶液之配製(注4)? 2.5.1.ABIPRISM7900HTSequenceDetectionSystem鉴别试验用 5μM引子F......................................1.25μL 5μM引子R......................................1.25μL 3.3μM探针P.....................................1.7μL TaqManUniversalPCRMasterMix...................12.5μL 检体DNA溶液(总量100ng).......................5.0μL 无菌去离子水.......................................3.3μL 总体积............................................25.0μL 2.5.2.RocheLightCycler鉴别试验用 5μM引子F.......................................1.5μL 5μM引子R.......................................1.5μL 3.3μM探针P.....................................1.5μL LightCyclerFastStartDNAMasterHybProbe..........2.0μL 25mM氯化镁溶液...................................2.4μL 检体DNA溶液(总量100ng)......................5.0μL 无菌去离子水.......................................6.1μL 总体积............................................20.0μL 注4:Real-timePCR溶液应置于冰浴中配製。 2.6.检体DNA之製备 2.6.1.检体之处理(注5) 乾燥检体直接以粉碎机研磨成细粉。溼状检体经冷冻乾燥处理后, 再以粉碎机研磨成细粉。检体需贮存于乾燥及冷冻环境中。 注5:1.研磨检体时应于区隔之空间进行,避免交叉污染。 2.溼状检体之乾燥时间可视乾燥程度调整。 2.6.2.DNA之抽取 採用适用于动物DNA抽取之市售套组,依套组操作说明步骤抽取 DNA。抽取之DNA溶液收集至已灭菌之1.5mL离心管,作为检 体DNA原液。依2.6.3.节测定DNA浓度后,置于-20℃冷冻 保存。 2.6.3.DNA浓度测定及纯度判断 取适量之检体DNA原液,以无菌去离子水做适当倍数之稀释,分 别测定260nm及280nm之吸光值(O.D.)。以波长260nm吸 光值乘50ng/μL及稀释倍数,即为检体DNA原液浓度。DNA 溶液纯度则以O.D.260/O.D.280比值作判断,其比值应介于1.7 ~2.0。 2.7.Real-timePCR鉴别试验 2.7.1.Real-timePCR操作步骤 2.7.1.1.Real-timePCR-ABIPRISM7900HTSequenceDetectionSyste m以无菌去离子水适当稀释检体DNA原液、引子及探针备用。 取PCR反应管,依照2.5.1.节配製PCR溶液,依序加入 TaqManUniversalPCRMasterMix、稀释过之引子及探针,混 合均匀后,分装20μL入PCR反应管中,各别加入检体DNA 溶液5μL,再将PCR反应管置于离心机中,以200?g瞬间离 心,移入real-timePCR反应器,依下列条件进行反应。同时 另製作正反应及负反应对照组。 ─────────────────────────── ?步骤温度时间 ─────────────────────────── 1.热活化50℃2min ─────────────────────────── 2.最初变性95℃10min ─────────────────────────── 3.变性95℃15sec 4.黏接、延展60℃1min 步骤3至步骤4,共进行45个循环反应。 ─────────────────────────── 5.冷却35℃45sec ─────────────────────────── 2.7.1.2.Real-timePCR-RocheLightCycler 以无菌去离子水适当稀释检体DNA原液、引子及探针备用。取 PCR反应管,依照2.5.2.节配製PCR溶液,依序加入Ligh- tCyclerFastStartDNAMasterHybProbe、25mM氯化镁溶液 、稀释过之引子及探针,混合均匀后,分装15μL于玻璃毛细 管中,各别加入检体DNA溶液5μL,再将毛细管置于离心机 中,以800?g瞬间离心,移入real-timePCR反应器,依 下列条件进行反应。同时另製作正反应及负反应对照组。 ─────────────────────────── 步骤温度时间 ─────────────────────────── 1.最初变性95℃10min ─────────────────────────── 2.变性95℃5sec 3.黏接60℃25sec 4.延展72℃8sec 步骤3至步骤4,共进行45个循环反应。 ─────────────────────────── 5.冷却35℃45sec ─────────────────────────── 2.7.2.Real-timePCR萤光分析 检体DNA经real-timePCR反应后,直接从real-timePCR 反应器上之萤幕观察探针所产生之萤光增幅曲线,即可判读反应结 果。同时另测试正反应及负反应对照组。 2.7.3.确认 检体DNA之real-timePCR增幅产物萤光分析图与正反应对照 组萤光分析图进行相互比对,当检体DNA与正反应对照组之re- altimePCR萤光分析图均出现经由探针所产生之萤光增幅曲线, 即确认该real-timePCR增幅产物为牛之基因片段,可确认该检 体中含有牛成分。 附注:1.本检验方法最低检测浓度为0.1%(以乾重计)。 2.检体DNA之製备将影响测试结果,检体DNA应进行内部对照 基因测试。 3.本方法反应条件分析不适时,可依所使用之仪器,设定适合之反 应条件。 4.本检验方法之测试範围係指能够抽取出DNA者之食品,经过高 度加工造成DNA过度裂解之食品不适用于本检验方法。 5.素食食品检验结果呈现微量牛成分阳性反应,建议可採用市售酪 蛋白等蛋白质检测套组,确认是否係添加乳清蛋白相关成分所致 。
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